|
蘇小軍a，熊興耀a，譚興和b，劉明月a
（湖南農業(yè)大學a.園藝園林學院；b.食品科學技術學院，湖南長沙 410128）
摘要：世界能源安全正面臨挑戰(zhàn)。清潔的可再生能源生物質燃料乙醇的發(fā)展越來越被重視。從生產原料、酶與微生物、技術和工藝等方面，概述了燃料乙醇發(fā)酵技術的研究進展，并展望了今后的研究方向。
能源是經濟和社會發(fā)展的基本動力。過去50年里，盡管煤、石油和天然氣的應用大大推動了世界經濟的發(fā)展和人類社會的進步，但這些化石能源都不可再生，無法實現可持續(xù)發(fā)展。按照已探明的儲備量和開采速度推算，全球石油的平穩(wěn)供應只能維持將近50年，天然氣不足100年，煤炭不足200年[1]。也就是說，地球上的化石能源資源在不遠的將來就會被耗盡，全球能源安全正面臨嚴峻挑戰(zhàn)。同時，化石能源的使用對環(huán)境污染和全球氣候的影響日趨嚴重，伴隨著能源消耗的不斷增加，全球環(huán)境污染物的排放量逐年加大。
生物質能是以生物質為載體的能量，即蘊藏在生物質中的能量，是綠色植物通過葉綠素將太陽能轉化為化學能而貯藏在生物質內部的能量形式。燃料乙醇是生物質能中最主要的能源之一，也稱燃料酒精。它是一種清潔的可再生能源，在整個生產和使用循環(huán)中，可以實現CO2的自身平衡，不增加溫室氣體的排放。燃料乙醇不僅可直接用作燃料，而且還可廣泛應用于電力、醫(yī)療、化工等領域。作為新的替代能源，燃料乙醇的研究和應用已被許多國家擺到了重要的戰(zhàn)略地位。
燃料乙醇是以生物質為原料，通過發(fā)酵、蒸餾、脫水得以制成。近年來，由于燃料乙醇產業(yè)的形成和發(fā)展，其生產技術與工藝的研究和改進受到了高度重視，形成了一個比較成熟的體系，在能源、環(huán)保和農業(yè)等領域發(fā)揮了重要作用。
1生物質原料
燃料乙醇生產的生物質原料主要包括3大類。第1類是糖質原料，包括甘蔗、甜高粱等；第2類是淀粉質原料，包括薯類、谷物等；第3類是纖維類原料，包括蘆葦、苧麻桿、秸稈和稻殼等。糖可經微生物發(fā)酵直接轉化為乙醇。淀粉和纖維素則需先水解為可發(fā)酵性糖，然后經發(fā)酵轉化為乙醇。
利用糖質和淀粉質原料生產燃料乙醇已有多年的歷史。美國于2006年首次超越巴西成為全球最大的燃料乙醇生產國。年產量達1460萬t。目前主要以玉米為原料。巴西為世界第二大燃料乙醇生產國，20世紀70年代就開始研發(fā)燃料乙醇。主要以甘蔗為原料。法國和德國是歐盟中燃料乙醇產量最多的國家。谷物、薯類和甜菜均為其生產原料。中國從20世紀末期開始由政府組織研究和開發(fā)燃料乙醇。現階段主要以玉米和小麥為原料。為了保證國家的糧食安全和滿足燃料乙醇產業(yè)進一步發(fā)展的需求，薯類、甜高粱、甘蔗等替代原料正得以迅速發(fā)展。
纖維類原料來源極為豐富，全球每年僅陸生植物就可產纖維素約5×1011t[2]，因此，利用纖維素生產燃料乙醇具有很大的潛力。由于纖維素類物質結構非常復雜，水解難度大，通常需經過一些預處理，如酸處理、堿處理、微波處理、蒸汽爆破處理等，才能被有效地降解為可發(fā)酵性糖。由于這些預處理成本高，廢水處理壓力大，再加上存在原料比較分散，體積大，運輸、貯藏費用高等問題，使得以纖維素為原料生產燃料乙醇的研究仍處于試驗階段，離商業(yè)化生產還有一段距離[3]。
2酶與微生物
燃料乙醇的生成是一個生物與化學反應的過程，可分為兩部分：一部分為有機底物，如纖維素、淀粉等，被纖維素酶、淀粉酶、糖化酶等水解為可發(fā)酵性糖的過程，另一部分為可發(fā)酵性糖被微生物轉化為乙醇和二氧化碳的過程。與整個過程相關的酶與微生物也可相應地被分成兩部分：一部分為負責水解糖化的纖維素酶、淀粉酶和糖化酶等及微生物；另一部分為負責將可發(fā)酵性糖轉化為乙醇的微生物。
淀粉質原料的水解相對來說比較容易，根霉、曲霉、枯草芽胞桿菌等所產生的酶系統均能有效地將淀粉水解為單糖。許多酵母菌，如Candida tsukubaensis CBS 6389，Filobasisium capsuligenum等也能產生淀粉酶和糖化酶[4]。糖化酶一般由催化域、連接域和結合域組成。黑曲霉糖化酶又分為GAⅠ和GAⅡ兩種類型，前者由催化域、連接域和結合域組成，后者為前者的水解產物，缺失淀粉結合域[5]。GAⅠ和GAⅡ對可溶解淀粉具有相同的催化水解能力。由于缺乏淀粉結合域，GAⅡ對不可溶解淀粉的水解能力比GAⅠ要弱得多。由于具有與生淀粉親和的功能部位，糖化酶能直接水解淀粉分子生成葡萄糖，其水解速率與能否被生淀粉分子吸附和吸附強度有關。淀粉酶可分為4大類：內切酶、外切酶、脫枝酶和轉移酶[6]。通常情況下，淀粉酶也存在吸附淀粉和不吸附淀粉兩種類型。前者具有水解淀粉的能力，后者則不具備，但也有研究發(fā)現，一些微生物所產生的淀粉酶不吸附淀粉，但對生淀粉卻有很強的水解能力[7]。
纖維素類原料為一類結構復雜的高分子聚合物，被酶水解很困難，效率較低。纖維素酶是由多種酶所構成的多組分酶系，包括外切酶、內切酶、纖維二糖酶及其他輔酶，它們協同作用，將纖維素水解為單糖。產纖維素酶的細菌有梭菌、纖維單胞菌、桿菌等，真菌有白絹菌、白腐真菌等。纖維素酶的水解機制存在兩種假說：一種認為，首先由內切酶在非結晶區(qū)進行切割，產生新的末端，然后再由外切酶以纖維二糖為單位進行水解，最后由纖維二糖酶將纖維二糖水解為葡萄糖；另一種認為，首先由外切酶水解纖維素為不溶性纖維素、可溶性纖維糊精和纖維二糖，然后再由內切酶水解纖維糊精成纖維二糖，最后由纖維二糖酶將纖維二糖水解為葡萄糖[3]。
產乙醇的微生物有細菌(如Clostridium sporogenes)、真菌(如Moniliasp)和酵母菌(如27817-Saccharomyces cerevisiae)，但應用最普遍的還是酵母菌，尤其是釀酒酵母[4]。釀酒酵母是傳統的乙醇生產菌株，具有良好的工業(yè)生產性狀。釀酒酵母基因全序列已被測定，其遺傳操作等技術已基本成熟，如利用其構建可利用木糖的工程菌株，構建能直接利用淀粉的工程菌株等。除釀酒酵母外，兼性厭氧細菌運動發(fā)酵單胞菌是另一個主要研究和開發(fā)的對象。與酵母菌相比，其具有吸收糖率高、產生物量少、耐乙醇能力強、發(fā)酵時無需控制加氧、耐高滲透壓、易于基因操作等優(yōu)點。但也有不足之處，如不能轉化復雜的碳水化合物如纖維素等；產生山梨醇、甘油、乙醛、乙酸等副產物；產生胞外果聚糖。工程細菌在燃料乙醇生產的研究和應用方面取得了很大的進展，其中利用基因工程的方法來改造運動發(fā)酵單胞菌、大腸埃希氏菌、產酸克雷伯氏菌等是目前的研究熱點，如構建運動發(fā)酵單胞工程菌代謝樹膠醛醣和木糖，利用基因工程大腸埃希氏菌同時轉化葡萄糖和木糖，構建產酸克雷伯氏工程菌發(fā)酵纖維二糖等。
3技術和工藝
3.1同步糖化發(fā)酵
傳統的乙醇生產工藝都是先糖化后發(fā)酵。同步糖化發(fā)酵法則采用邊糖化邊發(fā)酵原理，即原料不經預先糖化，直接進入發(fā)酵，糖化和發(fā)酵在一個反應器中同時進行。發(fā)酵液中可發(fā)酵性糖的含量始終保持在較低水平。發(fā)酵過程比較平穩(wěn)。同步糖化發(fā)酵法既免去了糖化工序，又削減了水解產物對糖化酶的反饋抑制，也降低了高濃度糖底物對酵母菌的抑制作用，因而使得乙醇產率較高[8]。
同步糖化發(fā)酵法可分為兩種類型。一是酶糖化與微生物發(fā)酵同步進行，如，Zhu等[9]以水稻秸稈為原料，采用纖維素酶與酵母菌共培養(yǎng)的方式進行同步糖化發(fā)酵，可使乙醇的最終質量濃度達25.8g/L，轉化率達57.5%；張德強等[10]以綠色木霉纖維素酶和釀酒酵母同步糖化發(fā)酵經汽爆處理后的毛白楊木粉，乙醇的轉化率高達86%，比分步糖化發(fā)酵法提高了1.6倍。二是糖化與發(fā)酵均采用微生物且同步進行。Verma等[11]以具有水解淀粉功能的酵母菌和釀酒酵母及擬內胞霉菌和釀酒酵母同步糖化發(fā)酵淀粉，可使乙醇的轉化率達93%，比同等條件下單菌種的培養(yǎng)和利用糖化酶、淀粉酶處理的傳統兩步法均要高。
除了能夠提高乙醇的產率外，同步糖化發(fā)酵法還可縮短發(fā)酵周期。Montesinos等[12]以小麥為原料，比較了先糖化6h再進行同步糖化發(fā)酵、先糖化后發(fā)酵和直接同步糖化發(fā)酵3種生產乙醇的方法，結果表明，直接同步糖化發(fā)酵法生產周期最短。
同步糖化發(fā)酵法存在的一個主要問題就是糖化和發(fā)酵的最適溫度不一致。一般來說，糖化的最適溫度高于50℃，而發(fā)酵的理想溫度低于40℃。為了解決這一矛盾，研究者們提出了非等溫同步糖化發(fā)酵法。但也有研究表明，非等溫同步糖化發(fā)酵法并不能提高乙醇產率。另外，選育耐熱酵母菌也是解決此矛盾的一條途徑。
3.2生料發(fā)酵
生料發(fā)酵是指原料不經蒸煮而直接進行糖化、發(fā)酵。與傳統的方法相比，生料發(fā)酵省去了高溫蒸煮工藝，具有降低能耗、提高乙醇產率、簡化操作工序、便于工業(yè)化生產等優(yōu)點[13]。
生料發(fā)酵的關鍵是生淀粉的水解糖化。這與淀粉的類型及淀粉酶、糖化酶的來源密切相關。根據被酶水解為葡萄糖的難易程度，淀粉質原料可分成3大類：第1類是容易被水解的，如蠟質玉米；第2類是較容易被水解的，如普通的玉米、大麥和木薯；第3類是不容易被水解的，如馬鈴薯[14]。生淀粉的水解難易程度與酶的來源有關。因此，不同類型原料生淀粉糖化的關鍵是篩選出適合其本身的酶或產酶的微生物。Mamo等[15]從嗜熱芽胞桿菌中純化出了兩種淀粉酶，淀粉酶Ⅰ和淀粉酶Ⅱ，在1U/mg的酶量條件下，兩者對馬鈴薯生料的水解率分別為77%和82%，而對玉米生料的水解率分別為44%和37%。Omemu等[16]從土壤中篩選出了一株黑曲霉，其產生的淀粉酶能夠水解多數淀粉質塊莖，如馬鈴薯、木薯、紅薯等，其中以對木薯生淀粉的水解能力最強。此外，培養(yǎng)條件也影響酶的產生和作用效果，如甘蔗渣培養(yǎng)基對黑曲霉生淀粉水解酶的誘導作用就大大強于普通的可溶性淀粉培養(yǎng)基[17]。另外，通過一些物理、化學、基因工程的方法，也可獲得較理想的生產菌株。
生料發(fā)酵是一個復雜的生物與化學過程，常采用同步糖化發(fā)酵工藝，受多種因素的影響。研究表明，對發(fā)酵液最終乙醇濃度的影響因素由大到小依次為原料種類、淀粉濃度、介質的pH值、發(fā)酵菌劑加量；對原料乙醇產生率的影響因素由大到小依次為原料種類、介質的pH值、發(fā)酵菌劑的加量、淀粉濃度[18]。
3.3固定化發(fā)酵
傳統的乙醇生產工藝采用游離細胞發(fā)酵。細胞隨發(fā)酵液不斷流走，造成發(fā)酵罐中細胞的濃度不夠大，乙醇產生速度慢，發(fā)酵時間長，且所用發(fā)酵罐多，設備利用率不高。采用固定化細胞發(fā)酵，細胞可連續(xù)使用，發(fā)酵罐中的細胞濃度始終保持很大，乙醇產生速度快，產量也高。田沈等[19]以海藻酸鈣為包埋介質，固定化運動發(fā)酵單胞菌，在10%葡萄糖培養(yǎng)基中多批次半連續(xù)發(fā)酵，可在8h內使乙醇產率系數達0.50，乙醇產率達理論值的98%，而同等條件下游離細胞的乙醇產率僅為理論值的88.2%(產率系數0.45)。Kobayashi等[20]以海藻酸鈣凝膠為載體，固定化可分泌淀粉酶的基因重組酵母菌，通過對淀粉直接發(fā)酵過程中的細胞生長、淀粉降解、葡萄糖積累、乙醇產生和糖化酶合成進行測定，并利用數學模型進行分析。結果表明，細胞固定法培養(yǎng)遠遠優(yōu)于細胞游離法培養(yǎng)，前者乙醇的產率為后者的10倍。
為進一步提高乙醇產率，研究者們又提出了同步糖化發(fā)酵與固定化相結合的混合發(fā)酵法，包括糖化酶與產乙醇微生物的共固定化、纖維素酶與產乙醇微生物的共固定化、糖化菌與產乙醇微生物的共固定化等。如，Fujii等[21]以纖維素為載體，共固定泡盛曲霉和巴斯德酵母菌進行同步糖化發(fā)酵，獲得的乙醇最大質量濃度可達25.5g/L，并且這個共固定化體系可重復使用3次，最終產生的乙醇質量濃度達66g/L。
3.4高濃度發(fā)酵
高濃度乙醇發(fā)酵目前尚未有統一的定義。現階段，乙醇生產企業(yè)淀粉質原料糖化液中可溶性固型物的質量分數多為20%～25%，因此有人將高濃度乙醇發(fā)酵定義為，每1L發(fā)酵液中含有30%或更高可溶性固型物的乙醇發(fā)酵[22]。一般情況下，企業(yè)通過發(fā)酵法所獲得的乙醇體積分數為8%～12%，而高濃度發(fā)酵可使乙醇的體積分數達到18%以上。高濃度乙醇發(fā)酵具有節(jié)約用水、提高單位設備的生產率、降低能耗、減少環(huán)境污染等優(yōu)點，是一種有很大應用價值的乙醇發(fā)酵技術。國內外對高濃度乙醇發(fā)酵的研究主要集中在兩個方面：一是高產和高耐受力菌種的選育；二是發(fā)酵工藝條件的研究。
乙醇是微生物的代謝產物，當累積到一定濃度時，它會對微生物產生毒害作用，表現為抑制其生長、存活、發(fā)酵等。以酵母菌為例，一般情況下，當發(fā)酵液中的乙醇體積分數達到23%時，酵母細胞不再生長，也不產生乙醇；只有當乙醇體積分數低于3.8%時，它對酵母菌的抑制作用才可忽略不計。不同微生物對一定濃度的乙醇有不同的耐受能力，因此，要實現高濃度乙醇發(fā)酵，首先需獲得高產和高乙醇耐受力的生產菌株。劉建軍等[23]從土壤、黃酒酒醅等樣品中分離篩選出產乙醇酵母，再經熱沖擊、紫外線和γ射線照射處理，最后獲得一株高產乙醇酵母菌，以玉米淀粉為原料，32℃發(fā)酵60～68h，可產乙醇17.5%以上，菌種對乙醇的耐受度超過20%。
除了與酵母菌耐受乙醇的能力有關外，高濃度乙醇的生產還與發(fā)酵過程中細胞所處的外部環(huán)境和工藝密切相關。由于高濃度乙醇發(fā)酵存在的主要問題是產物抑制、高滲透壓和營養(yǎng)不足，因此培養(yǎng)基的成分、糖的濃度、發(fā)酵溫度、乙醇濃度等都是影響其發(fā)酵時間和效率的重要因素。Reddy等[24]往高濃度乙醇發(fā)酵(含糖30%～40%)基質中添加4%～6%的扁豆粉，結果乙醇的產量增加了50%，同時副產物甘油的產量也大大降低。他們認為扁豆粉不僅供給了酵母菌營養(yǎng)，而且其內含的物理和化學因子對于降低高滲透壓可能也發(fā)揮了重要作用。
4展望
能源、環(huán)境和“三農”問題是長期困擾中國經濟社會發(fā)展的3大重要問題。發(fā)展燃料乙醇產業(yè)不僅有助于保證中國能源供應安全，改善生態(tài)環(huán)境，而且還能拓寬農業(yè)服務領域，為農民增收開辟新途徑，因此，“十一五”期間，進一步發(fā)展燃料乙醇產業(yè)，對于構建中國能源安全新體系和促進社會和諧發(fā)展，具有重要的現實意義和戰(zhàn)略意義。按照《變性燃料乙醇及車用乙醇汽油“十一五”發(fā)展專項規(guī)劃》，“十一五”期間，中國將生產燃料乙醇500萬t，到2020年，生產燃料乙醇1500萬t。目前，我國燃料乙醇的產能還不到200萬t。因此，未來燃料乙醇產業(yè)在中國有巨大的發(fā)展空間。
原料問題是中國燃料乙醇產業(yè)發(fā)展所需要解決的首要問題。由于受多種因素限制，纖維素燃料乙醇目前還難以產業(yè)化，糖質和淀粉質仍是生產的主要原料來源。“十五”期間，中國主要以玉米、小麥等為原料生產燃料乙醇。為了保障糧食安全，中國燃料乙醇的進一步發(fā)展需要建立新的原料體系。薯類、甜高粱、甘蔗等經濟作物將是構成這一體系的主體部分。因此，下一階段的研究重點應是如何實現這些經濟作物的高效大規(guī)模生產，并將其所蘊藏的能量高效地轉化為燃料乙醇。
目前，燃料乙醇的生產還存在成本偏高、能耗較大的問題，因此，有關燃料乙醇生產的研究也主要集中在這兩方面。原料成本是影響總成本的主要因素，所以對燃料乙醇生產的原料進行比選很重要。有研究表明，與玉米和小麥相比，無論是原料成本，還是單位面積燃料乙醇產量，薯類均處于優(yōu)勢地位[25-26]。因此，發(fā)酵技術的研究也應更多地針對這類原料開展。
在生產工藝方面，同步糖化發(fā)酵法工藝簡單、建設投資少，可使燃料乙醇的生產成本降低20%以上[27-28]。該工藝的一個關鍵問題就是如何協調好糖化與發(fā)酵的最適溫度。由于免去了高溫蒸煮工藝，生料發(fā)酵法具有顯著的節(jié)能效應。該項技術目前已引起了整個燃料乙醇業(yè)的極大關注。生料發(fā)酵的關鍵是生淀粉的水解糖化，因此生淀粉糖化酶、淀粉酶的分離純化、生淀粉糖化菌的選育、生淀粉基因工程菌的構建一直是人們研究的重點。高濃度發(fā)酵即可節(jié)約發(fā)酵過程中的能耗，又能減少下游工程蒸餾的能耗，在一定程度上有效地實現了節(jié)能。因此，只要解決好產物抑制、高滲透壓、營養(yǎng)不足等相關問題，該項技術也將會展示出誘人的應用前景。此外，多種發(fā)酵技術的結合使用可同時減少投資、縮短發(fā)酵周期和提高乙醇產率，起到降低生產成本、減少能耗的作用，也是一個重要的發(fā)展方向。
參考文獻：
[1]唐煉.世界能源供需現狀與發(fā)展趨勢[J].國際石油經濟，2005，13(1)：30-33.
[2]李盛賢，賈樹彪，顧立文。利用纖維素原料生產燃料 酒精的研究進展[J].釀酒，2005，32(2)：13-16.
[3]朱圣東，吳元欣，喻子牛，等.植物纖維素原料生產 燃料酒精研究進展[J].化學與生物工程，2003(5)：5-11.
[4]Yan Lin，Shuzo Tanaka。Ethanol fermentation from biomass resources：Current state and prospects[J].Appl Microbiol Biotechnol，2006，69：627-642.
[5]Catherine A G Cornett，Tsuei-Yun Fang，Peter J，et al.Starch-binding domain shuffling in Aspergillus niger glucoamylase[J].Protein Engineering，2003，16(7)：521- 529.
[6]van der Maarel M J E C，van der Veen B。Uitdehaag J C M，et al.Properties and applications of starch-converting enzymes of a-amylase family[J].Journal of Biotechnology，2002，94：137-155.
[7]Lynn M Hamilton，Catherine T Kelly，Willian M Fogarty.Raw starch degradation by non-raw starch- adsorbing bacterial alpha amylase of Bacillus sp.IDM 434[J].Carbohydrate Research，1998，314：251-257.
[8]劉振，王金鵬，張立峰，等。木薯干原料同步糖化發(fā)酵生產乙醇[J].過程工程學報，2005，5(3)：353-356.
[9]Zhu Shengdong，Wu Yuanxin，Yu Ziniu，et al.Simultaneous saccharification and fermentation of microwave/alkali pre-treated rice straw to ethanol[J].Biosystems Engineering，2005，92(2)：229-235.
[10]張德強，張志毅，黃鎮(zhèn)亞.木質纖維素一步法(SSF) 轉化成乙醇的研究.Ⅲ毛白楊爆破原料一步法轉化成乙醇的研究[J].北京林業(yè)大學學報，2000，22(6)：50-54.
[11]Verma G，Poonam Nigam，Dalel Singh，et al.Bioconversion of starch to ethanol in a single-step process by coculture of amylolytic yeasts and Saccharomy cerevisiae 21[J].Bioresource Technology，2000，72：261-266.
[12]Thierry Montesinos，Jean-Marie Navarro。Production of alcohol from raw wheat flour by Amyloglucosidase and Saccharomyces cerevisiae[J].Enzyme and Microbial Technology，2000，27：362-370.
[13]鄒東恢，梁敏，馬翠翠.生料釀酒技術的應用與開發(fā)[J].釀酒科技，2005(6)：61-64.
[14]Atsuo Kimura，John F Robyt。Reaction of enzymes with starch granules：Kinetics and products of the reaction with glucoamylase[J].Carbohydrate Research，1995，277：87-107.
[15]Gashaw Mamo，Amare Gessesse.Purification and characterization of two raw-starch-digesting thermostable a-amylases from a thermophilic Bacillus[J].Enzyme and Microbial Technology，1999，25：433-438.
[16]Omenu A M，Akpan I，Bankole M O，et al.Hydrolysis of law tuber starches by amylase of Aspergillus niger AM07 isolated from the soil[J].African Journal of Biotechnology，2005，4(1)：19-25.
[17]ABU E A，ADO S A，James D B.Raw starch degrading amylase production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on sorghum pomace[J].African Journal of Biotechnology，2005，4(8)：785-790.
[18]李祥，呂嘉櫪，李小奎.生料釀酒工藝技術研究[J].釀酒科技，2002(6)：42-44.
[19]田沈，王菊，陳新芳，等.固定化運動發(fā)酵單胞菌乙醇發(fā)酵研究[J].太陽能學報，2005，26(2)：219-223.
[20]Fumihisa Kobayashi，Yoshitoshi Nakamura.Mathematical model of direct ethanol production from starch in immobilized recombinant yeast culture[J].Biochemical Engineering Journal，2004，21：93-101.
[21]Fujii N，Oki T，Sakurai A，et al。Ethanol production from starch by immobilized Aspergillus awamori and Saccharomyces pastorianus using cellulose carriers[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2001，27：52-57.
[22]侯保朝，杜風光，郭永豪，等.高濃度酒精發(fā)酵[J].釀酒科技，2005(4)：93-96.
[23]劉建軍，姜魯燕，趙祥穎，等.高產酒精酵母菌種的選育[J]。釀酒，2003，30(1)：57-59。
[24]Reddy L V A，Reddy O V S。Improvement of ethanol production in very high gravity fermentation by horse gram(Dolichos biflorus) flour supplementation[J].Letters in Applied Microbiology，2005，41(5)：440-444.
[25]蘇小軍，熊興耀，譚興和，等.馬鈴薯等農作物生產燃料乙醇的性能比較[C]//馬鈴薯產業(yè)與冬作農業(yè).哈爾濱：哈爾濱工程大學出版社，2006.
[26]曾麟，王革華.中國甘蔗燃料乙醇生產的技術、經濟和環(huán)境可行性分析[J].可再生能源，2006(4)：46-49.
[27]Hinman N D，Schell D J，Riley C J，et al.Preliminary estimate of the cost of ethanol production for simultaneous saccharification and fermentation technology[J].Appl Biochem Biotechnol，1992，34/35：639-649.
[28]Van Sivers M，Zacchi G.A techno-economical comparison of three processes for the production of ethanol from pine[J].Bioresource Technol，1995，51：43-52. |
